獸藥殘留消除試驗指導原則

獸藥殘留消除試驗指導原則

一、概述

（一）定義與目的

獸藥殘留對消費者可能產生毒害作用，從而影響人類的健康和消費安全。用于食品動物的獸藥產品均需通過殘留消除試驗制定休藥期。休藥期，是指為符合食品安全國家標準動物性食品中獸藥最大殘留限量，使用獸藥后的動物在屠宰上市或其產品（蛋、奶）允許用作人的食品前停止使用獸藥的一段時間。為保障動物性食品安全，特制定本指導原則。

（二）適用范圍

凡申請在食品動物（如牛、羊、豬、禽等）使用的獸藥均需進行殘留消除試驗確定休藥期。

二、分析方法

由于殘留消除試驗樣品一般來自動物可食性組織或蛋、奶等產品，具有取樣量少、藥物濃度低、內源性物質干擾多（如激素、維生素、膽汁以及可能同服的其他藥物）以及個體差異大等特點，因此必須建立靈敏、專一、精確、可靠的生物樣品定量分析方法，并對方法進行確證。

分析方法可采用標準方法、非標準方法以及允許偏離的標準方法。

標準方法包括：國家標準、農業部公告、CAC、AOAC、美國FSIS、歐盟等檢測方法標準。允許偏離的標準方法包括：超出標準規定范圍使用的標準方法；經過擴充或更改的標準方法。

標準方法和允許偏離的標準方法按照方法學驗證的要求進行驗證。非標準方法需要按照獸藥殘留檢測方法制定要求進行。

分析方法一般采用外標法，當絕對回收率達不到要求或有可能影響定量等其他因素時，建議采用內標法。優先選擇待測分析物的同位素替代化合物作為內標，也可以使用不影響殘留消除試驗結果準確性的其他物質作為內標。

測定時一般采用標準溶液或空白基質添加標準物質溶液制備的標準曲線進行定量。使用的標準物質必須符合國家相關規定的賦值溯源。

（一）常用分析方法

目前常用的分析方法主要有：

1.色譜法：高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、色譜－質譜聯用法（LC-MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數藥物的檢測。從目前發展看，生物樣品的分析一般選擇色譜法，這類方法靈敏度、特異性、準確性一般都能適應殘留消除研究的需要。具體選用何種分析方法應根據藥物的化學結構、理化性質、儀器條件以及借鑒文獻方法多方面因素來考慮確定。

2.免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質多肽類物質的檢測。

3.微生物學方法：主要用于抗生素或部分抗寄生蟲藥的檢測，如果抗微生物藥的代謝產物仍有抗菌活性，則不宜選用微生物法。

（二）方法學驗證

方法學驗證是整個殘留消除研究的基礎。為了保證分析方法可靠，必須對方法進行充分驗證，一般應進行以下幾方面的考察。

1.特異性

指在樣品中存在干擾成分的情況下，分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力。必須證明所測定物質是受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物，生物樣品所含內源性物質和相應代謝物、降解產物不得干擾對樣品的測定，如果有幾個分析物，應保證每個分析物都不被干擾。應確定保證分析方法的最佳檢測條件。對于色譜法至少要考察空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖。采用LC-MS、LC-MS/MS法時應考察分析過程中的基質效應，基質效應應不超過LOQ的20%。

2.標準曲線和定量范圍  

標準曲線反映了所測定物質濃度與儀器響應值之間的關系，一般用回歸分析法（如用加權最小二乘法等）所得的回歸方程來評價。應提供標準曲線的線性方程和相關系數，說明其線性相關程度。標準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。

配制標準樣品應使用與待測樣品相同的生物基質。不同的樣品應制備各自的標準曲線。用于建立標準曲線的濃度個數取決于分析物可能的濃度范圍和分析物濃度/響應值關系的性質。必須至少用5個濃度建立標準曲線，對于非線性相關可能需要更多濃度點。定量范圍要能覆蓋全部待測的生物樣品濃度范圍，不得用定量范圍外推的方法求算未知樣品的濃度。當所需測定樣品中藥物濃度超出定量范圍時，應采取科學的稀釋步驟，使得被測藥物濃度在定量范圍之內。建立標準曲線時應隨測空白生物樣品，但計算時不包括該點，僅用于評價干擾。當線性范圍較寬的時候，推薦采用加權的方法對標準曲線進行計算，以使低濃度點計算得比較準確。標準曲線需經統計學分析，如進行相關性與回歸分析。相關系數要求：色譜法應大于0.99，生物法應大于0.98。

有些分析（如微生物分析）可能需要對數（log）轉換才能達到線性，而其他分析[如酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）]可能需要更復雜的數學函數以確立濃度與響應值之間的關系。也應通過評價選定函數生成的殘差確認使用該函數時的可接受性。

3.檢測限和定量限  

建立分析方法時，應測定背景信號（噪音）的標準偏差，確定方法的檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。LOD為噪音均值加3倍標準差，LOQ為噪音均值加10倍標準差。LOQ一般是標準曲線的最低濃度，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。LOQ原則上應低于1/2MRL。

4.準確度與精密度  

準確度指分析物實際濃度值與用該方法得到的平均結果之間接近的程度。準確度與系統誤差（分析方法偏差）和分析物回收率（以回收率%測量）密切相關。殘留物分析法的建議準確度隨分析物濃度變化而變化。準確度應符合下述范圍：

*μg/kg = ng/g = ppb

精密度是指在確定的分析條件下，相同基質中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。通常用質控樣品的批內和批間RSD來考察方法的精密度。

*按照Horwitz公式計算：CV=2^(1-0.5logC)，式中，C=以小數表示的濃度（例如，1μg/kg輸入為10^-9）。

一般要求選擇高、中、低3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考察。低濃度選擇標準曲線的最低濃度；高濃度接近于標準曲線的上限；中間選一個濃度。在測定批內精密度時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間精密度應至少在不同天連續制備并測定3個分析批，至少45個樣品。

5．樣品穩定性  

根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意考察儲備液的穩定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩定性，以保證檢測結果的準確性和重現性。

（1）基質中穩定性

殘留物消除研究中采集的樣品（組織、乳汁、蛋或蜂蜜）一般在分析前冷凍儲存。分析前需確定這些樣品可在擬定儲存條件下儲存的時間。作為驗證程序的一部分或作為單獨研究時，需進行穩定性研究確定儲存條件（如4℃、-20℃或-70℃）及樣品分析前儲存時間。

應向樣品添加已知量的分析物，并在適當條件下儲存。可在規定時間分析樣品（例如，開始時、1周、1個月、3個月）。如果凍存樣品，應進行凍融研究（至少凍融3次，每天1次）。或者，可在初始分析中使用真實樣品測定起始濃度。基質中穩定性評估的建議方案為對接近驗證范圍上限和下限的2個不同濃度重復分析3次。在確立的準確度驗收標準內，如果在規定穩定性時間點得到的平均濃度與初始分析或剛剛添加對照樣品的分析結果一致，判定基質中穩定性為可接受。

（2）處理樣品的穩定性

樣品一般處理1天并在次日分析，如果出現儀器故障，可多儲存幾天，如1周。必要時可測定在處理樣品儲存條件下的穩定性。儲存條件示例為室溫儲存4～24小時和4℃冷藏48小時等。可按照方法要求研究其他儲存條件。處理樣品穩定性評估的建議方案為對接近驗證范圍上限和下限的2個不同濃度重復分析3次。在確立的準確度驗收標準內，如果在規定穩定性時間點得到的平均濃度與初始分析或剛剛添加并處理的對照樣品分析結果一致，判定處理樣品的穩定性為可接受。

6．微生物學分析

上述分析方法確證的很多參數和原則也適用于微生物學或免疫學分析，但在方法確證中應考慮到它們的一些特殊之處。微生物學或免疫學分析的標準曲線本質上是非線性的，所以應采用比化學分析更多的濃度點來建立標準曲線。結果的準確度是關鍵因素，如果重復測定能夠改善準確度，則應在方法確證和未知樣品測定中采用同樣的步驟。

微生物學或免疫學分析方法確證實驗應包括在幾天內進行的6個分析批，每個分析批包括4個濃度（LOQ，低、中、高濃度）的質控雙樣本。

7．質量控制

應在生物樣本分析方法確證完成以后開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應進行質量控制，以保證所建立的方法在實際應用中的可靠性。推薦由獨立的分析人員配制不同濃度的質控樣品對分析方法進行考核。

每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。來自同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。每個分析批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，并隨行測定高、中、低3個濃度的質控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試序列中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質控樣品數，使質控樣品數大于未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應小于15%，低濃度點偏差一般應小于20%。如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果不可采用。

標準曲線的范圍不能外延，任何濃度高于定量上限的樣品，應采用相應的空白基質稀釋后重新測定。對于濃度低于定量限的樣品，在進行休藥期分析時，應以無法定量（Not detectable，ND）計算。

整個分析過程應當遵從預先制訂的實驗室SOP以及GLP、GCP原則。

三、試驗設計

（一）受試藥物

受試藥物應與擬上市的制劑完全一致、同一劑型，有完整的產品質量標準，有符合規定格式的說明書。受試藥物應來源于同一批號，由申報單位自行研制并在符合GMP條件下的車間生產，并提供產品檢驗合格報告。

（二）動物及飼養管理

應選擇具有代表性的商業品種和靶動物群，要提供動物來源、體重、健康狀況、年齡和性別等數據。

產品適用的不同靶動物應分別進行消除試驗。在肉牛進行的試驗結果可以應用于非泌乳奶牛，反之亦可。成年反芻動物牛、羊的數據可以外推到犢牛和羔羊，若有證據表明反芻動物反芻前和成年之間的代謝有明顯不同，需要單獨進行反芻前犢牛和羔羊的消除試驗。

對于泌乳期奶牛/羊需單獨進行奶中的殘留消除試驗，制定棄奶期。

用于乳房內灌注研究的奶牛必須是無乳房炎的健康奶牛。

所有動物在試驗前必須有足夠的適應期，飼養過程盡可能接近商業正常的方式。動物自由采食和飲水。

（三）動物數量

不同動物的消除試驗每個采樣點對動物的要求如下：

1．牛、羊及豬體內組織殘留消除試驗

最少16只動物分4個采樣點進行殘留消除試驗。每個采樣點至少4個動物。建議動物體重分別為：牛約250～400kg、羊約30～60kg、豬約40～80kg。

2．奶中殘留消除試驗

對于泌乳期的動物，高產奶量動物和低產奶量動物每組至少各10頭；對于干乳期的動物，至少應有20頭動物。

3．禽的殘留消除試驗

組織殘留消除試驗必須保證至少4個采樣點，每個點6只動物；蛋中殘留試驗必須保證至少4個采樣點，每個采樣點收集10枚或以上的蛋。

（四）給藥

給藥途徑和方式必須按照標簽、說明書進行，如用于注射的產品，要遵守給藥部位和給藥方法的規定。對于多次給藥的產品，注射給藥必須在動物的左右兩側相同部位交替給藥。

給藥劑量采用標簽推薦最高的劑量，給藥時間采用標簽推薦最長的給藥療程時間，對于連續或長期使用的藥物，選擇殘留標示物在動物體內可食性組織中達到穩態的時間。可以預先進行一個殘留標示物達到穩態濃度的測定試驗，以確定殘留標示物在動物體內可食性組織中達到穩態的時間。

乳房灌注的藥物制劑必須同時給予4個乳區。干乳期給藥必須在最后一次泌乳后和下一次分娩前進行。

如果一個產品可以用于多種腸道外途徑給藥，則要求分別進行殘留消除試驗。如果休藥期是依據注射位點的消除數據制定，這時不需要再進行靜注給藥的消除試驗。

用于全身治療作用具有多個經皮膚給藥途徑（如浸漬、噴霧和澆潑）的產品，應選擇藥物吸收量和程度最佳的皮膚給藥途徑進行殘留消除試驗。

動物屠宰采用商業方式，一般采用放血處死。不允許采用化學處死方法。

（五）采樣

在停藥當天（牛、羊、豬組織8～12小時，家禽組織2～6小時，奶2～12小時）必須有一個采樣點，最后一個采樣點應低于殘留限量。

在每個采樣點，要采集足夠量的樣品。采集的樣品不得進行任何洗滌或處理，所取樣品應立即均勻分成若干等份、包裝并做好標記，保存于-20℃冰箱，對于殘留物有可能不穩定的樣品應置于相應要求的溫度下存放至測定。

推薦的可食性組織采樣方式見表1。

表1 殘留消除試驗中推薦的可食性組織采樣方式

肌注和皮下注射給藥的產品，必須采集最后一次給藥注射位點的肌肉。其他經皮給藥的藥物也要進行給藥位點的藥物殘留測定，比如澆潑劑要采集給藥部位的肌肉、皮下脂肪等。

如果分析的樣品為兩種或兩種以上的復合樣品，如帶皮的脂肪（豬、禽），則不再單獨進行脂肪、皮的測定。牛、羊的脂肪樣品僅指腎周脂肪，豬和禽應采集皮脂。

乳樣應該在最后一次給藥后按照每日兩次的擠奶程序的間隔時間下采集。在每個時間點，將每頭動物所有乳區的全部奶混合在一起后，進行采樣。對于多次給藥的產品，乳樣應該從最后一次給藥后采集。

給藥和采樣要考慮蛋黃的形成時間（一般為12天）。蛋白和蛋黃要混在一起進行分析檢測。對于多次給藥的產品，在給藥期間也要進行蛋樣采集。

（六）休藥期為零天的殘留消除試驗

代謝試驗預測休藥期為0天的產品，無論單次給藥、多次給藥，還是連續給藥，都可以通過單時間點采樣試驗進行證實。

進行單時間點采樣試驗的動物數量最低要求為：禽12羽，牛、羊、豬6頭，產奶動物10頭。

采樣時間設置，最短不能少于3小時，最長不超過12小時。一般來說，家禽約6小時，牛、羊、豬約12小時；奶約12小時。

（七）樣品測定  

樣品中殘留量必須采用經驗證的定量檢測方法進行檢測。每種組織均進行平行雙樣品測定。

（八）數據匯總與分析

編制靶動物殘留消除規律數據匯總表，列出每個時間點的全部實測數據。

靶動物組織中殘留休藥期可以采用WT1.4軟件（Withdrawal-Time Calculation Program）或相當的程序進行計算，奶中殘留休藥期可以采用WTM1.4軟件（Withdrawal-Time Calculation Program for Milk）或相當的程序進行計算。確定制定休藥期的靶組織和最終推薦的休藥期。

四、試驗報告

殘留檢測方法的確認試驗可以和殘留消除試驗合并撰寫報告，也可以單獨按照《獸藥殘留檢測方法驗證指導原則》規定的格式撰寫報告。報告應符合GLP和GCP的質量管理要求。

來源;獸藥評審中心

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