石家莊鑫富達醫藥包裝有限公司是專業生產塑料包裝的知名企業,公司從業二十余年,以精湛的技術、完善的管理體系、精益求精的產品服務于廣大客戶。產品遠銷到亞洲、歐洲、南北美洲等地區。是中國獸藥協會理事單位，受農業部（農業農村部）委托參與制定獸藥包裝團體標準。富于厚德，達于至善。
查看詳情獸藥重復給藥毒性試驗技術指導原則
一、概述
（一）目的
重復給藥毒性試驗是描述動物重復接受受試物后的毒性特征，它是非臨床安全性評價的重要內容。重復給藥毒性試驗可以：①預測受試物可能引起的靶動物臨床不良反應，包括不良反應的性質、程度、量效關系、時效關系、可逆性等；②判斷受試物重復給藥的毒性靶器官或靶組織；③確定未觀察到不良反應劑量（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL），是制定日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI）和動物性食品最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）的重要數據；④為臨床試驗不良反應監測及防治提供參考。
（二）適用范圍
本指導原則適用于獸用化學藥物、獸用中藥和獸用天然藥物。消毒劑參考使用。
二、基本原則
獸藥重復給藥毒性試驗須遵守《獸藥非臨床研究質量管理規范》或《藥物非臨床研究質量管理規范》。
試驗設計要結合受試物理化性質和作用特點，需關注與其他藥理毒理試驗設計和研究結果的關聯性，關注同類藥物靶動物臨床使用情況及適應證等，重復給藥毒性試驗結果應與其他藥理毒理試驗研究互為說明、補充或/和印證。
（一）受試物
化學藥物：受試物應采用工藝相對穩定、純度和雜質含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。應注明受試物名稱、來源、批號、生產日期、含量（或規格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規格和生產單位等，并符合試驗要求。
中藥、天然藥物：受試物應采用能充分代表臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。應采用工藝路線及關鍵工藝參數確定后的工藝制備，一般應為中試或中試以上規模的樣品，否則應有充分的理由。應注明受試物的名稱、來源、批號、生產日期、含量（或規格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。由于中藥的特殊性，建議現用現配，否則應提供數據支持配制后受試物的質量穩定性及均勻性。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規格及生產單位。
在藥物研發的過程中，若受試物的工藝發生變化可能影響其安全性的，應進行相應的安全性研究。
化學藥物試驗過程中應進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應進行受試物樣品分析。
重復給藥毒性試驗通常采用兩種實驗動物，一種為嚙齒類（通常首選大鼠），另一種為非嚙齒類（通常首選Beagle犬）。特殊情況可選用其他種屬或品系動物。動物應對受試物敏感，來源、品系、遺傳背景清楚。
實驗動物應符合國家對相應等級動物的質量規定要求，具有實驗動物質量合格證明。
一般選擇正常、健康、性成熟動物，雌雄兼用，使用一種性別動物應給出理由，同性別體重差異應在平均體重的20%之內。
動物年齡：應根據試驗期限等確定動物年齡，一般大鼠選擇6～8周齡（不超過9周），Beagle犬為6～12月齡，動物年齡應盡量接近，應注明開始給藥時動物年齡。
動物數量：每個劑量組動物數，嚙齒類一般不少于15只/性別（主試驗組10只，恢復組5只），非嚙齒類一般不少于5只/性別（主試驗組3只，恢復組2只）。
（三）給藥方案
1. 給藥劑量：重復給藥毒性試驗原則上至少應設低、中、高3個劑量組，以及1個溶媒（或輔料）對照組，必要時設立空白對照組和/或陽性對照組；高劑量原則上使動物產生明顯的毒性反應，低劑量原則上相當或高于動物藥效劑量或臨床使用劑量的等效劑量，中劑量應結合毒性作用機制和特點在高劑量和低劑量之間設立，以考察毒性的劑量-反應關系。
劑量設計應考慮之前進行的各項試驗所評價的終點、受試物的理化性質和生物利用度等；局部給藥應保證充分的接觸時間。高劑量應出現明顯毒性反應，或達到最大給藥量（Maximum Feasible Dose，MFD），或系統暴露量達到臨床系統暴露量的100-300倍（基于AUC）。如需要在試驗中途改變給藥劑量，應說明劑量調整理由，完整記錄劑量調整過程。
2. 給藥途徑：原則上應與臨床擬用途徑一致，如不一致則應說明理由。用于支持制定ADI的重復給藥毒性試驗，給藥途徑為經口給藥。
3. 給藥頻率：原則上，動物應每天給藥，特殊類型的受試物就其毒性特點和臨床給藥方案等原因，可根據具體藥物的特點設計給藥頻率。
4. 試驗期限：建議分階段進行重復給藥毒性試驗，通過較短試驗期限的毒性試驗獲得的信息，可以為較長試驗期限的毒性試驗設計提供給藥劑量、給藥頻率、觀察指標等方面的參考。試驗期限可以根據擬定的臨床療程和用藥方式等進行設計，試驗期限應與所支持的給藥療程相匹配，如果存在不同療程的多個適應證，可按最長療程確定試驗期限。具體支持關系見下表。
適應證療程/試驗期限 | 嚙齒類動物 | 非嚙齒類動物 |
≤2周 | 1個月 | 1個月 |
2周～1個月 | 3個月 | 3個月 |
1個月～3個月 | 6個月 | 6個月 |
>3個月 | 6個月 | 9個月1，2 |
用于制定ADI3 | 至少包含3個月和12個月 | 至少包含3個月和12個月 |
注：
1. 當免疫原性或耐受性問題使更長期限的試驗難以進行時；擬用于危及生命的疾病（晚期腫瘤）時，非嚙齒類動物可接受不超過6個月期限的試驗。
2．如果用于幼齡動物，而已有藥理毒理研究結果提示可能存在發育毒性，應考慮采用幼齡動物進行長期毒性試驗。
3. 用于制定日允許攝入量（ADI）的經口重復給藥毒性試驗：是確定NOAEL的關鍵試驗，必須包含嚙齒類和非嚙齒類的90天喂養試驗以及一年口服慢性毒性試驗，使用一種動物應給出理由。嚙齒類慢性毒性和致癌性合并實施時，小鼠需要18個月或公認的轉基因小鼠6個月，大鼠24個月。
（四）檢測指標
重復給藥毒性試驗應進行的檢測指標詳見附表。此外，還應結合受試物的特點及其他試驗中已觀察到的改變或背景信息（如關于處方組成成分毒性的文獻等），在不影響正常毒性觀察和檢測的前提下增加合理的指標。實驗動物相關指標的歷史數據在重復給藥毒性試驗中具有重要的參考意義。
在結束動物安樂死時進行一次全面檢測；當試驗期限較長時，應根據受試物的特點及相關信息選擇合適的時間點進行階段性檢測；試驗期間對瀕死或死亡動物應及時采集標本進行檢測，分析瀕死或死亡的原因；恢復期結束時進行一次全面的檢測。
給藥前應對動物進行適應性飼養，嚙齒類動物應不少于5天，非嚙齒類動物不少于2周。在適應性飼養時，對實驗動物進行外觀體征、行為活動、攝食情況和體重檢查，非嚙齒類動物至少應進行2次體溫、血液學、血液生化學和至少1次心電圖檢測。
給藥期間，根據試驗期限的長短和受試物的特點確定檢測時間和檢測次數。原則上應盡早發現毒性反應，并反映出觀測指標或參數變化與試驗期限的關系。
給藥結束，對主試驗組動物進行系統的大體解剖，稱重主要臟器并計算臟器系數；進行組織病理學檢查，首選進行對照組和高劑量組病理學檢查，如果高劑量出現病變則降序檢測中低劑量相應器官，應出具完整的病理學檢查報告，如發現有異常變化，應附有相應的組織病理學照片。非嚙齒類動物對照組和各給藥組主要臟器組織均應進行組織病理學檢查；嚙齒類動物對照組、高劑量組、尸檢異常動物應進行詳細檢查，如高劑量組動物某一組織發生病理改變，需要對其他劑量組動物的相同組織進行組織病理學檢查；通常需要制備骨髓涂片，以便當受試物可能對動物造血系統有影響時進行骨髓檢查。
給藥結束后，繼續觀察恢復期動物，以了解毒性反應的可逆性和可能出現的遲發毒性；應根據受試物代謝動力學特點、靶器官毒性反應和恢復情況確定恢復期的長短，28天重復給藥毒性試驗，一般恢復期不少于2周，90天以上重復給藥毒性試驗，一般恢復期應不少于4周。
重復給藥毒性試驗根據而需要可伴隨進行伴隨毒代動力學試驗，具體內容參照《獸藥毒代動力學研究技術指導原則》。
四、結果分析與評價
采用合適的統計學方法，對試驗數據進行處理。分析重復給藥毒性試驗結果，判斷動物是否發生毒性反應及毒性靶器官，描述毒性反應的性質和程度（包括毒性反應的起始時間、程度、變化規律和消除時間）、性別差異，如果有動物死亡應分析死亡原因，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機制。擬用于食品動物的獸藥，其重復給藥毒性得到的NOAEL值，是制定ADI時綜合評估最重要的參數之一。中毒劑量小于推薦劑量2～3倍的各種原料藥一般不能作為獸藥使用，蓄積系數小于3的原料藥一般不能長期添加使用。
（一）正確理解試驗數據的意義
在對重復給藥毒性試驗結果進行分析時，應正確理解均值數據和個體數據的意義。嚙齒類動物重復給藥毒性試驗中組均值的意義通常大于個體動物數據的意義，實驗室歷史背景數據和文獻數據可以為結果的分析提供參考；非嚙齒類動物單個動物的試驗數據往往具有重要的毒理學意義，是試驗動物數量較少、個體差異較大的原因。此外，非嚙齒類動物試驗結果必須與給藥前數據、對照組數據和實驗室歷史背景數據進行多重比較，要考慮文獻數據參考價值有局限性。在分析重復給藥毒性試驗結果時應綜合考慮數據的統計學意義和生物學意義，正確利用統計學假設檢驗有助于確定試驗結果的生物學意義，要考慮“具有統計學意義”并不一定代表“具有生物學意義”；在判斷生物學意義時要考慮參數變化的劑量-反應關系、其他關聯參數的改變、與歷史背景數據的比較等因素；分析試驗結果時，須對出現的異常數據應判斷是否由受試物毒性引起并給予科學解釋。
（二）正確判斷毒性反應
給藥組和對照組之間檢測結果的差異可能來源于受試物有關的毒性、動物對藥物的適應性改變或正常的生理波動，也可能源于試驗操作失誤和動物應激。在分析試驗結果時，應關注參數變化的劑量－反應關系、組內動物的參數變化幅度和性別差異，同時綜合考慮多項毒理學指標的檢測結果，分析其中的關聯和受試物作用機制，以正確判斷藥物的毒性反應。單個參數的變化往往并不足以判斷化合物是否引起毒性反應，可能需要充分分析或進一步進行相關試驗。此外，毒代動力學試驗可以為毒性反應和毒性靶器官的判斷提供重要參考依據。
（三）綜合評價
重復給藥毒性試驗是藥物非臨床安全性研究的有機組成部分，是藥物非臨床毒理學研究中綜合性最強、獲得信息最多和對臨床指導意義最大的一項毒理學試驗，其NOAEL值也是制定ADI綜合評估最重要的參數之一。對其結果進行評價時，應結合受試物的藥學特點，藥效學、藥代動力學和其他毒理學的試驗結果等進行綜合評價。
重復給藥毒性試驗的實驗動物毒性反應結果與靶動物安全試驗的靶動物毒性反應可能存在差異，可能的原因為：①不同物種、種屬或個體之間對某一物質的毒性反應可能存在差異，或者代謝途徑及代謝產物存在差異；②重復給藥毒性試驗中通常采用較高的給藥劑量，可能存在非線性動力學代謝過程相關的毒性反應。
五、試驗報告
按照獸藥GLP要求撰寫試驗報告。
六、附錄
（一）不同情況中藥的試驗要求
考慮到中藥各類藥物處方來源、立題依據等差別，在具體進行試驗時可參照以下要求進行。
1．未在國內上市銷售的從中藥、動物、礦物等物質中提取的有效成分及其制劑，新發現的藥材及其制劑，藥材新的藥用部位及其制劑，未在國內上市銷售的從中藥、動物、礦物等物質中提取的有效部位制成的制劑，未在國內上市銷售的中藥注射劑。以上情況，由于其物質基礎較傳統中藥發生了明顯改變，或應用經驗較少，采用嚙齒類動物進行重復給藥毒性試驗。
2．未在國內上市銷售的由中藥組成的非注射給藥的復方制劑，采用嚙齒類動物進行重復給藥毒性試驗。若該類處方中含有毒性藥材、無法定標準藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌時，則應進行嚙齒類和非嚙齒類的重復給藥毒性試驗。
毒性藥材：系指收入國務院《醫療用毒性藥品管理辦法》的中藥品種。即：砒石、砒霜、水銀、生馬錢子、生川烏、生草烏、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘蟲、紅娘蟲、生甘遂、生狼毒、生藤黃、生千金子、生天仙子、鬧羊花、雪上一枝蒿、紅升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、紅粉、輕粉、雄黃。另外，凡在近年來發現的有毒性作用的藥材（原材料）或在復方中含有明顯有毒組分的，均按毒性藥材處理。
3． 4．
5.
（二）檢測指標表
項目類別 | 指標 | |
1.臨床觀察 | 外觀、體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀、給藥局部反應、死亡情況等。 | |
2.攝食量、體重、眼科檢查 | ||
3.體溫和心電圖檢測（非嚙齒動物） | ||
4.血液學檢測 | 紅細胞計數、血紅蛋白、紅細胞容積、平均紅細胞容積、平均紅細胞血紅蛋白、平均紅細胞血紅蛋白濃度、網織紅細胞計數、白細胞計數及其分類、血小板計數、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間等。 | |
5.血液生化學檢測 | 天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶、堿性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮（尿素）、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、γ-谷氨酰轉移酶、鉀離子濃度、氯離子濃度、鈉離子濃度。 | |
6.尿液觀察和分析 | 尿液外觀、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿膽紅素、尿膽原、酮體、潛血、白細胞。 | |
7．組織病理學檢查的臟器組織 | ⑴需稱重并計算臟器系數的器官 | 腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮、甲狀腺（含甲狀旁腺）1。 |
⑵需進行組織病理學檢查的組織或器官 | 腎上腺、主動脈、骨（股骨）、骨髓（胸骨）、腦（至少3個水平）、小腸、大腸、子宮和子宮頸、附睪、食管、眼2、膽囊（如果有）、哈氏腺（如果有）、心臟、腎臟、肝臟、肺臟（附主支氣管）、淋巴結（一個與給藥途徑相關，另一個在較遠距離）、乳腺、卵巢和輸卵管、胰腺、垂體、前列腺、唾液腺、坐骨神經、精囊（如果有）、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾臟、胃、睪丸、胸腺（或胸腺區域）、甲狀腺（含甲狀旁腺）、氣管、膀胱、陰道、所有大體觀察到異常的組織、組織腫塊和給藥部位。 | |
注：1. 僅在非嚙齒類動物稱重。2. 如果眼科檢查時有變化
七、參考文獻
1. 農業部. 獸藥30天和90天喂養試驗指導原則，農業部公告第1247號，2009.
2. 農業部. 獸藥慢性毒性和致癌試驗指導原則，農業部公告第1247號，2009.
3. 農業部. 獸藥臨床前毒理學評價試驗指導原則，農業部公告第1247號，2009.
4. 國家藥品監督管理局藥品審評中心. 藥物重復給藥毒性研究技術指導原則，2014.
5. VICH GL37. Studies to evaluate the safety of residues of veterinary drugs in human food: repeat-dose chronic toxicity testing，2006.
6. VICH GL31. Studies to evaluate the safety of residues of veterinary drugs in human food: repeat-dose (90 days) toxicity testing，2006.
7. OECD Guideline 408. Repeated dose 90-day oral toxicity study in rodents，2018.
8. OECD Guideline 409. Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents，1998.
9. OECD Guideline 452. Chronic Toxicity Studies，2018.
10. EMA. Guideline on repeated dose toxicity，2010.
來源：獸藥評審中心
原文下載：
獸藥重復給藥毒性試驗技術指導原則.doc
微信掃一掃